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細胞計數(shù)實驗

點擊次數(shù):1303  更新時間:2020-05-25
 
 
實驗用品
 
0.4%臺盼藍溶液、無水乙醇或95%乙醇溶液、脫脂棉
普通顯微鏡、試管、吸管、毛細吸管、細胞計數(shù)板、綢布。
 
實驗原理
 
在細胞培養(yǎng)工作中,常需要了解細胞生活狀態(tài)和鑒別細胞死活,確定細胞接種濃度和數(shù)量以及了解細胞存活率和增殖度,如用酶消化制備的細胞懸液中細胞活力的鑒別,凍存細胞復蘇后的活力檢測等。細胞懸液制備后,常用活體染料臺盼藍對細胞進行染色,進行細胞計數(shù)。臺盼藍不能透過活細胞正常完整的細胞膜,故活細胞不著色。而死亡細胞的細胞膜通透性增高,可使染料進入細胞內(nèi)而使細胞著色(藍色)。細胞計數(shù)一般用血細胞計數(shù)板,按白細胞計數(shù)方法進行計數(shù),便于確定細胞的生活狀況。
 
實驗內(nèi)容與方法
 
(一)制備動物細胞懸液
 
將動物細胞用生物鹽水制備成適當濃度的細胞懸液備用。
 
(二)細胞計數(shù)
 
1. 計數(shù)板處理
用無水乙醇或95%乙醇溶液擦拭計數(shù)板后,用綢布擦凈,另擦凈蓋玻片一張,把蓋片覆在計數(shù)板上面。
 
2. 染色
用滴管吸取0.4%臺盼藍染液,按1∶1比例加入細胞懸液中。從計數(shù)板邊緣緩緩滴入,使之充滿計數(shù)板和蓋片之間的空隙中。注意不要使液體流到旁邊的凹槽中或帶有氣泡,否則要重做。稍候片刻,將計數(shù)板放在低倍鏡下(10×10倍)觀察計數(shù)。
 
3. 計數(shù)方法
按圖計算計數(shù)板的四角大方格(每個大方格又分16個小方格)內(nèi)的細胞數(shù)。計數(shù)時,只計數(shù)完整的細胞,若聚成一團的細胞則按一個細胞進行計數(shù)。在一個大方格中,如果有細胞位于線上,一般計下線細胞不計上線細胞,計左線細胞不計右線細胞。二次重復計數(shù)誤差不應超過±5%(圖7-1)。鏡下觀察,凡折光性強而不著色者為活細胞,染上藍色者為死細胞。
 
4. 計數(shù)的換算
計完數(shù)后,需換算出每ml懸液中的細胞數(shù)。由于計數(shù)板中每一方格的面積為0.01 cm2,高為0.01 cm,這樣它的體積為0.0001 cm3,即0.1 mm3。由于1 ml=1000 mm3,所以每一大方格內(nèi)細胞數(shù)×10 000=細胞數(shù)/ml,故可按下式計算:
細胞懸液細胞數(shù)/ml=4個大格細胞總數(shù)/4×10 000
如計數(shù)前已稀釋,可再乘稀釋倍數(shù)。
計數(shù)細胞后,計算細胞懸液濃度并求出存活與死亡細胞數(shù)的比例。
 
注意事項:
向計數(shù)板中滴細胞懸液時要干凈利落,加量要適當,過多易使蓋片漂移,或淹過蓋片則失敗,需重做,過少易出現(xiàn)氣泡;不理想時,應重做;
鏡下計數(shù)時,若方格中細胞分布明顯不均,說明細胞懸液混合不均勻,需重新將細胞懸液進行混合,再重新計數(shù)。
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